PCR实验中引物设计原则以及常见问题汇总
阅读次数:20 发布时间:2019/7/23 11:38:03
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PCR实验中引物设计原则以及常见问题汇总


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PCR-引物设计原则

1.引物*在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.引物长度一般在15~30碱基之间。

引物长度(primer length)常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

3.引物GC含量在40%~60%之间,Tm值*接近72℃。

GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(melting temperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。

有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值*接近72℃以使复性条件*佳。

4.引物3′端要避开密码子的第3位。

如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。

5.引物3′端不能选择A,*选择T。

引物3′端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的碱基为A时,即使在错配的情况下,也能有引发链的合成,而当末位链为T时,错配的引发效率大大降低,G、C错配的引发效率介于A、T之间,所以3′端*选择T。

PCR常见问题答疑!


 


1. 如果扩增曲线ct值比较靠后的话,32左右,一般有什么方法解决?

 

ct值比较靠后,对实验有一定的影响,因为经过那么多次的循环,酶的活性有可能有所下降,这时候扩增效率会有所改变(而定量PCR的理论基础就是每次循环的扩增效率我们认为是确定的一个值)。因此*能够把ct值往前移。

 

解决办法可以将模板加以浓缩或者抽干之后用少量水去溶解。

 

2. 为什么合成的引物做不加摸板的对照也能扩增出目的条带,而内参用同样体系就没有呢?

 

 

 

引物被污染。

 

 

 

3. 实时定量PCR,荧光定量PCR,实时荧光定量PCR,real-time PCR,这些是不是同一个概念

 

 

 

是一个概念。

 

 

 

4. 我的标准曲线的slope总是大于4,而且每个梯度的平行ct值差别比较大,原因?

 

 

 

这个斜率是=1/LOG 10(扩增效率),理论上扩增效率=2,斜率是3.322。如果斜率大于4,说明扩增效率比较小。可以考查一下反应体系是否合理?酶活是否正常?

 

平行管的CT值差别大可以考查一下自己实验操作是否规范,另外一种原因就是仪器本身的误差也可能会导致CT值差别比较大。

 

 

 

当斜率为4的时候,扩增效率是77.8%,斜率大于4的话,效率继续下降。

 

扩增效率的问题实际就是引物的扩增效率,可能酶活的关系没有那么重要,前提是试剂盒的质量有保证。回到扩增效率,只有在引物和模板处于*适比例时才能得到比较满意的扩增效率,因此通过调节PCR反应体系中的引物终浓度来解决,可以做一些引物梯度来比较。

实验步骤
一、 样品RNA的抽提
 
1.  取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。
 
2.  两相分离 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
 
3.  RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
 
4.  RNA清洗 移去上清液,每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7 000 rpm离心5分钟。
 
5.  RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
 
6.  溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水4 0ul用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
 
二、 RNA质量检测
 
1.  紫外吸收法测定
 
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。
 
 (1)浓度测定
 
A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:A260 x 稀释倍数 x 40 ug/ml。具体计算如下:
 
RNA溶于40 ul DEPC水中,取5 ul,1:100稀释至495 ul的TE中,测得A260 = 0.21
 
RNA 浓度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul
 
取5 ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 ul,剩余RNA总量为:
 
35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug
 
(2)纯度检测
 
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。
 
2.  变性琼脂糖凝胶电泳测定
 
(1)制胶
 
1 g琼脂糖溶于72 ml水中,冷却至60℃,10 ml的10 x MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10x MOPS电泳缓冲液
浓度  成分
0.4 M  MOPS,pH 7.0
0.1 M  乙酸钠
0.01 M  EDTA
 
灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1xMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
 
(2)准备RNA样品
 
取3 ugRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 ug/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
 
(3)电泳
 
上样前凝胶须预电泳5 min,随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。
 
(4)紫外透射光下观察并拍照
 
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。
 
三、样品cDNA合成
 
1.  反应体系
 
序号          反应物           剂量
1          逆转录buffer       2 ul
2         上游引物              0.2 ul
3         下游引物              0.2 ul
4          dNTP                   0.1 ul
5       逆转录酶MMLV     0.5 ul
6         DEPC水              5 ul
7          RNA模版            2 ul
8           总体积               10 ul
 
轻弹管底将溶液混合,6 000 rpm短暂离心。
 
2.  混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟,取出后立即冰水浴至管内外温度一致,然后加逆转录酶0.5 ul,37℃水浴60分钟。
 
3.  取出后立即95℃干浴3分钟,得到逆转录终溶液即为cDNA溶液,保存于-80℃待用。
 
四、 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(β-actin)实时定量PCR
 
1.  β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011,反应前取3 μl按10倍稀释(加水27 ul并充分混匀)为1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104,以备用。
 
2.  反应体系如下:
 
标准品反应体系
 
序号           反应物                           剂量
1       SYBR Green 1 染料             10 ul
2       阳性模板上游引物F              0.5 ul
3      阳性模板下游引物R              0.5 ul
4                 dNTP                            0.5 ul
5                 Taq酶                           1 ul
6           阳性模板DNA                    5 ul
7              ddH2O                            32.5 ul
8               总体积                            50 ul
 
轻弹管底将溶液混合,6 000 rpm短暂离心。
 
3.  管家基因反应体系:
 
序号            反应物                                剂量
1      SYBR Green 1 染料                   10 ul
2      内参照上游引物F                         0.5 ul
3     内参照下游引物R                         0.5 ul
4               dNTP                                    0.5 ul
5               Taq酶                                   1 ul
6      待测样品cDNA                             5 ul
7              ddH2O                                  32.5 ul
8             总体积                                    50 ul
 
轻弹管底将溶液混合, 6000 rpm短暂离心。
 
3.  制备好的阳性标准品和检测样本同时上机,反应条件为:93℃ 2分钟,然后93℃ 1分钟,55℃ 2分钟,共40个循环。
 
五、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
 
1.  针对每一需要测量的基因,选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
 
2.  反应体系
 
序号                     反应物                        剂量
1                     10× PCR缓冲液            2.5 ul
2                           MgCl2 溶液              1.5 ul
3                           上游引物F                 0.5 ul
4                           下游引物R                0.5 ul
5                            dNTP混合液            3 ul
6                            Taq聚合酶               1 ul
7                             cDNA                       1 ul
8                    加水至总体积为               25 ul
 
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
 
35个PCR循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟); 72?C延伸5分钟。
 
(3)PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
 
(4)将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
 
六、 待测样品的待测基因实时定量PCR

1.  所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。
 
2.  体系配置如下:
 
序号             反应物                                剂量
1            SYBR Green 1 染料               10 ul
2                上游引物                               1 ul
3                下游引物                               1 ul
4                  dNTP                                   1 ul
5              Taq聚合酶                               2 ul
6             待测样品cDNA                        5 ul
7                   ddH2O                              30 ul
8                   总体积                               50 ul
 
轻弹管底将溶液混合,6 000 rpm短暂离心。
 
(3)将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为:93℃ 2分钟预变性,然后按93℃ 1分钟,55℃1分钟,72℃1分钟,共40做个循环,*后72℃7分钟延伸。
 
七、 实时定量PCR使用引物列表
 
引物设计软件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原则:引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
 
八、电泳
 
各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,GoldView染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
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注意事项

1。荧光阈值:在荧光扩增曲线指数增长长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量标准)。荧光阈值可设定在指数扩增阶段任意位置上,但实际应用要结合扩增效率,线性回归系数等参数来综合考虑。

 

2.Ct值:在PCR扩增过程中,扩增产物(荧光信号)到达阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值具有极好的重复性。

其他

实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值的计算,根据标准曲线获得定量结果。因此,实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的:

 

1)Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,因此Ct值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的Ct值是恒定的。
 

2)Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定,因此,实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。

 

外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量*准确,重现性*的定量方法,已得到全世界的公认,广泛用于基因表达研究、转基因研究,药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

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